近年二代基因測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)快速發(fā)展，其應(yīng)用已進展至臨床檢測，如遺傳疾病、實體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細(xì)胞抗原分析及非侵襲性產(chǎn)前篩查等。中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會和中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專委會前期組織病理、臨床、生物信息等專家進行了充分討論，擬在 NGS 的操作流程、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果解讀等方面作規(guī)范和建議，以規(guī)范 NGS 在分子病理領(lǐng)域的應(yīng)用。

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臨床分子病理實驗室 NGS 樣（formalin-fixedparaffin-embedded，F(xiàn)FPE）、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細(xì)胞塊、石蠟包埋標(biāo)本和血漿 / 血液標(biāo)本等。本共識特色是基于病理評估的組織樣本（FFPE、新鮮）的規(guī)范。測序分析范圍基于目前臨床需求，本共識著重在于目標(biāo)區(qū)域測序（panel）分析的實踐。隨著技術(shù)的更新和應(yīng)用的成熟，本共識將持續(xù)更新以滿足臨床需求。

一、實驗室總體要求

1. NGS 檢測人員的資質(zhì)要求：NGS 檢測技術(shù)人員應(yīng)具備臨床病理學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)專業(yè)大專以上學(xué)歷，并經(jīng)過 NGS 技術(shù)的理論與技能培訓(xùn)合格。數(shù)據(jù)分析人員應(yīng)具有臨床醫(yī)學(xué)或分子生物學(xué)或遺傳學(xué)知識背景并經(jīng)生物信息學(xué)培訓(xùn)。最終報告應(yīng)由中級或碩士以上具有病理學(xué)背景、經(jīng)培訓(xùn)合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或者授權(quán)簽字人 (醫(yī)學(xué)博士學(xué)位或高級職稱) 審核。

2. NGS 檢測實驗室的區(qū)域設(shè)置要求：原則上 NGS 實驗室應(yīng)當(dāng)有以下分區(qū)：樣本前處理區(qū)、試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)、雜交捕獲區(qū) / 多重 PCR 區(qū)域（第一擴增區(qū)）、文庫擴增區(qū)（第二擴增區(qū)）、文庫檢測與質(zhì)控區(qū)、測序區(qū)、數(shù)據(jù)存貯區(qū)。各工作區(qū)空氣及人員流向需要嚴(yán)格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則》。分區(qū)可根據(jù)實際情況合并，但是在前處理和建庫時，血液樣本應(yīng)與組織樣本分開。

3. NGS 檢測試劑及項目要求：試劑和測序平臺均應(yīng)選擇中國食品藥品監(jiān)督管理總局 (CFDA) 認(rèn)可產(chǎn)品。涉及到實驗室自配試劑，應(yīng)該有嚴(yán)格的試劑制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），需經(jīng)過臨床實驗室自建項目 (LDT) 驗證合格才可使用。每個 NGS 檢測項目在驗證時需要根據(jù)建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類型包括，單堿基突變 single nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷貝數(shù)變異 Copynumber variations（CNVs）、染色體結(jié)構(gòu)變異，structuralvariation（SVs）以及不同的樣本類型（如 FFPE 組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定 panel 的準(zhǔn)確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數(shù)進行 LDT 驗證。應(yīng)該有經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品測試的在不同的 mutant allele frequencies（MAF）下，不同測序深度的靈敏度及特異性數(shù)據(jù)，確定不同樣本的可信的測序深度。經(jīng)驗證后，SOP 發(fā)生的任何改動，包括試劑、儀器、基因項目等都需要重新做驗證。驗證實驗結(jié)果簽名留底備案。

4. NGS 檢測實驗室的質(zhì)量管理要求：NGS 檢測主要包括實驗操作和生物信息學(xué)分析兩部分。實驗操作部分包括樣本準(zhǔn)備、文庫制備、編碼（barcoding）、目標(biāo)區(qū)域富集、測序等；生物信息學(xué)分析部分包括定位（mapping）、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。上述流程均需要建立實驗室質(zhì)量管理體系文件和 SOP 及機器運行和維護 SOP，具有嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控措施；定期參加室間質(zhì)評以有及持續(xù)的質(zhì)量保證和改進計劃。

二、NGS 分析樣本、基因 panel 和轉(zhuǎn)運要求

? NGS 分析樣本類型可采用 FFPE 樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細(xì)胞塊石蠟包埋標(biāo)本和血漿 / 血液標(biāo)本等。
? 對于腫瘤體細(xì)胞變異初次 NGS 檢測應(yīng)首-選經(jīng)病理評估的組織樣本，在此數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上的再次檢測可選取液體樣本動態(tài)監(jiān)測。
? NGS 檢測前需通過病理診斷明確其腫瘤的性質(zhì)及含量，根據(jù)不同腫瘤類型選擇合適的基因 panel 測序。
? 不同疾病的基因 panel 列表，必須由臨床與檢測機構(gòu)的專家共同決定，已達到不同實驗室之間的可比性和完善性。
? 未經(jīng)病理評估的基因檢測結(jié)果不可單獨用于分子病理臨床診斷目的。
? 樣本質(zhì)量對檢測結(jié)果和分析至關(guān)重要，病理醫(yī)師需要對可評估的樣本進一步明確病理診斷，并評價標(biāo)本有無出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理（例如含 HCl 脫鈣液處理），病變細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞含量建議達到 20% 以上，低于此標(biāo)準(zhǔn)可富集后檢測。
? NGS 檢測實驗室應(yīng)對不同類型的樣本有采集及處理 SOP 指導(dǎo)。對于不同的樣本（FFPE、體液、血液等）實驗室應(yīng)有不同的樣本運送 SOP，物流環(huán)節(jié)（含冷鏈運輸）應(yīng)有相關(guān)運送記錄，確保樣本運送安全、無污染、無降解。

三、NGS 檢測流程中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1. 核酸提取及其質(zhì)量分析：提取的核酸質(zhì)量是 NGS 檢測成功的關(guān)鍵因素，在制備文庫前應(yīng)采用多種方法對核酸質(zhì)量評估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據(jù)不同的樣本類型制定相應(yīng)的 SOP 用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對應(yīng)明確接受和拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。

2. 文庫制備及其質(zhì)量分析：文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫，無論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應(yīng)對檢測基因、區(qū)域或突變熱點進行描述，并建立實驗室檢測 SOP。建立好文庫后上機測序前需對文庫進行質(zhì)量分析。每個檢測項目應(yīng)設(shè)定其文庫質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標(biāo)準(zhǔn)。

3. NGS 測序儀上機分析及其質(zhì)量分析：NGS 建庫主要有擴增法和捕獲法兩大策略，測序時根據(jù)檢測樣本量和質(zhì)量要求確定適當(dāng)?shù)男酒?，以保證測序質(zhì)量和靶區(qū)覆蓋深度。錄入樣本編號、檢測內(nèi)容、設(shè)定參數(shù)等信息，按儀器操作流程進行測序。

4. NGS 檢測中的樣本追蹤及對照設(shè)置：
（1）樣本追蹤：為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個 SNV 位點或其他標(biāo)簽作為樣本身份標(biāo)識（sample ID），在檢測前對每個樣本進行 SNV 位點信息的測定，在 NGS 檢測后對上述位點進行追蹤，證明沒有交叉污染。
（2）陽性對照：應(yīng)用組合型質(zhì)控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復(fù)雜性。實驗時同時檢測，以確保其檢出能力。
（3）陰性對照：用無核酸或明確無突變的樣本作為模板同時進行檢測，以確保檢測過程中沒有污染或非特異性。
（4）應(yīng)對方案和替代方法：各個質(zhì)量控制步驟中如出現(xiàn)異常或失敗，實驗室應(yīng)有應(yīng)對措施或備選方案；對于測序結(jié)果質(zhì)量差或有問題的區(qū)域應(yīng)建立替代方法（如 Sanger 測序）。

四、生物信息分析

NGS 數(shù)據(jù)的生物信息分析可分為兩個主要步驟：一是對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控分析及過濾。二是對通過質(zhì)控的序列進行變異位點鑒定分析并注釋。所用各種生物信息分析軟件，都要通過適量標(biāo)準(zhǔn)品測序數(shù)據(jù)進行驗證，證明所用軟件及參數(shù)可達到臨床報告的要求。

1. NGS 生物信息分析流程標(biāo)準(zhǔn)：
（1）質(zhì)控分析：為保證分析結(jié)果的可靠性，需要對原始的測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制與過濾。測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制主要包含 4 個方面：質(zhì)量評估、去接頭序列、去低質(zhì)量序列、去重復(fù)序列。
（2）序列比對（mapping）：將通過質(zhì)控后每一條 read 與參考基因組進行比對，回貼到基因組上最佳位置。
（3）變異鑒定：對每個位點進行變異鑒定。在腫瘤 panel 測序中，主要檢測 SNV 和 Indel 兩種突變類型，參數(shù)調(diào)整后可分析 CNV。部分 panel 的設(shè)計還可以鑒定染色體易位。對于腫瘤 panel 基因測序數(shù)據(jù)，鑒定后的變異位點都需要進行該位點可視化查看和確認(rèn)，如 The IntegrativeGenomics Viewer (IGV)。
（4）變異注釋：基于通用數(shù)據(jù)庫，對突變基因位點進行功能注釋，詳見下文。

2. NGS 生物信息分析流程質(zhì)量管理：實驗室應(yīng)建立生物信息學(xué)程序 /Pipeline 的書面質(zhì)量管理 (QM) 計劃文件。必須包含每次運行時監(jiān)測和評估運行性能的指標(biāo)和質(zhì)控參數(shù)，以及定期（例如每月、每季度）監(jiān)測的指標(biāo)和質(zhì)控參數(shù)。指標(biāo)和質(zhì)控參數(shù)可包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)品的突變類型及百分比。生物信息分析流程建立后，需要采用已知變異類型和變異頻率的標(biāo)準(zhǔn)品進行驗證，驗證其特異性和靈敏度是否達到實驗室要求。驗證結(jié)果簽名留底備案。
（1）NGS 數(shù)據(jù)存儲：實驗室需要在生物信息分析過程中對原始數(shù)據(jù)及最后的結(jié)果數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化存儲，并要保存相應(yīng)的年限以備查。
（2）版本可追溯性：每份病例數(shù)據(jù)分析報告中，生物信息數(shù)據(jù)分析流程所涉及軟件、算法、參數(shù)及數(shù)據(jù)庫的版本必須可溯源。
（3）異常記錄。實驗室需要建立一個異常記錄文檔，用來記錄偏離 NGS 生物信息分析標(biāo)準(zhǔn)分析流程的檢測。

3. NGS 生物信息分析質(zhì)量指標(biāo)

4. NGS 數(shù)據(jù)存儲格式標(biāo)準(zhǔn)：為了規(guī)范和管理各類數(shù)據(jù)，各個實驗室需按照編號進行數(shù)據(jù)管理，所有數(shù)據(jù)按照國際標(biāo)準(zhǔn)格式進行存儲。必須建立本地變異數(shù)據(jù)庫（用于檢驗變異真實性）。

5. NGS 數(shù)據(jù)存儲傳輸及共享安全標(biāo)準(zhǔn)：實驗室需要制定規(guī)章制度以確認(rèn)測序。數(shù)據(jù)在內(nèi)部及外部存儲及傳輸過程中的安全性和機密性。正常人群的變異數(shù)據(jù)應(yīng)該共享。

五、NGS 結(jié)果解釋及報告

1. NGS 臨床報告包含內(nèi)容：基于高通量測序技術(shù)，臨床實驗室比較容易的獲取更高通量的臨床樣本檢測數(shù)據(jù)，不可避免會檢測到意義未知的變異位點，在實際工作中會有一定的不確定性。

2. 基因變異的命名：在描述所檢測出的基因變異時要遵循一定的原則和規(guī)范，推薦使用人類基因組變異協(xié)會命名指南。對于遺傳病相關(guān)基因變異命名，推薦美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)院

3. 臨床意義的解讀和批注：對于腫瘤體細(xì)胞突變，根據(jù)突變的類型和已有的報道及指南，基因變異提倡分級的處理方式

4. B 級：尚未進入診療指南，但已經(jīng)寫入該領(lǐng)域的專家共識的變異位點。注釋時要批注研究報道及專家共識的來源，明確其藥物及其臨床意義、正在開展的狀態(tài)等信息。
? ? C 級：FDA 或 CFDA 批準(zhǔn)用于其他腫瘤可預(yù)測療效的基因變異，或者正在進行中的臨床試驗變異位點。注釋時要批注用于其他腫瘤的權(quán)威指南，研究文獻及臨床試驗正在開展的狀態(tài)等信息。
? ? D 級：處于學(xué)術(shù)爭議或臨床意義不明確的基因變異。同一實驗室應(yīng)該有統(tǒng)一的政策用來應(yīng)對檢測過程中出現(xiàn)的臨床意義不明變異情況。
對于以上幾種情況在報告的時候注意客觀平實地描述檢測的結(jié)果，在病理報告中不能出現(xiàn)建議使用何種治療手段或策略的語言。

5. 意義不明位點的處理：由于通量的增加和人種差異，臨床腫瘤樣本可能發(fā)現(xiàn)新的變異位點。實驗室必須制定相關(guān)政策方案用來應(yīng)對檢測過程中出現(xiàn)的臨床意義不明變異情況。政策可以是一發(fā)現(xiàn)變異就報告，但附上說明和意義。也可以是不報道這些發(fā)現(xiàn)或只報道小部分變異結(jié)果。