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For All You Seq…-DNA Protein Interactions

導(dǎo)讀

由干細(xì)胞搜丨干細(xì)胞搜網(wǎng)編輯： DNA文庫構(gòu)建：

DNA Protein Interactions

1.DamID

DNA腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶相互作用檢測

DamID允許在活細(xì)胞中鑒定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)而無需交聯(lián)或免疫沉淀。它在2006年作為微陣列方法開發(fā)，然后才適應(yīng)NGS?（Vogel等，2006）。

DamID涉及由DNA腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（Dam）和感興趣的染色質(zhì)蛋白組成的融合蛋白的低水平表達(dá)。該融合蛋白靶向染色質(zhì)蛋白的天然結(jié)合位點(diǎn)，其中Dam甲基化周圍DNA中的腺嘌呤。隨后，分離甲基化的DNA片段，通過選擇性PCR擴(kuò)增，并測序。

好處：

允許在活細(xì)胞中鑒定蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，而無需交聯(lián)或免疫沉淀

提供專用算法?（Li et al。，2015）

缺點(diǎn)：

大壩可能有毒

模仿千字節(jié)大小的地區(qū)

2.DNase I SIM

DNase I簡化植物的核 – 核方法

該方法是專門用于植物的簡化DNase I方案（Cumbie等，2015）。它包含在DNase I消化之前在Percoll梯度中進(jìn)行細(xì)胞核純化的額外步驟，以更有效地去除細(xì)胞碎片和淀粉顆粒。使用T4 DNA聚合酶的DNA末端拋光步驟在DNA酶I消化后直接在細(xì)胞核中進(jìn)行。這些額外的步驟消除了對凝膠純化及其伴隨的材料損失的需要。

好處：

不需要凝膠純化

缺點(diǎn)：

僅針對植物進(jìn)行了優(yōu)化

MNase-SEQ /

微球菌核酸酶測序/微球菌核酸酶_輔助分離核小體/分離的核小體測序/分離的核小體測序

微球菌核酸酶（MNase）來源于金黃色葡萄球菌，其首次用于確定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的歷史可以追溯到1975年，當(dāng)時該方法被稱為各種核葡萄球菌核酸酶或微球菌核酸酶消化細(xì)胞核或染色質(zhì)?（Sollner-Webb et al。， 1975）?（Axel等，1975）。隨著NGS的出現(xiàn)，MNase消化?（Schones等人，2008）?變得更加流行，并且最終創(chuàng)造了術(shù)語MNase-Seq?（Kuan等人，2009）。術(shù)語MNase輔助分離核小體測序（MAINE-seq）?（Cusick等，1981）?（Ponts等，2010），Nucleo-Seq?（Valouev等，2011）和Nuc-seq?（Chodavarapu等，2010）?不常用。與目的蛋白融合的MNase也已用于鈣依賴性切割以研究體內(nèi)特定的基因組基因座（ChEC-seq）?（Zentner等，2015）。

在MNase-Seq中，用MNase處理gDNA。保護(hù)染色質(zhì)蛋白結(jié)合的序列免受MNase消化。接下來，提取來自DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的DNA并用于制備測序文庫。深度測序可準(zhǔn)確表示基因組中調(diào)節(jié)DNA結(jié)合蛋白的位置?（Schones等，2008）

好處：

可以繪制核小體和其他DNA結(jié)合蛋白?（Zentner等，2012）

足跡亞核小體顆?？杀Ｗo(hù)低至約25 bp?（Henikoff等，2011）

識別基因組中各種調(diào)節(jié)蛋白的位置

涵蓋廣泛的監(jiān)管網(wǎng)站

缺點(diǎn)：

MNase位點(diǎn)可能不占整個基因組

AT依賴性序列偏倚?（Kensche等，2016）

MNase與ChIP數(shù)據(jù)的整合對于鑒定和區(qū)分相似的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)是必要的

4.X-ChIP

高分辨率交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀測序

交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀（X-ChIP）是染色質(zhì)研究的基礎(chǔ)技術(shù)?（Breiling等，2001）?（Negre等，2001）。隨著NGS的出現(xiàn)，這種簡單的技術(shù)，現(xiàn)在稱為X-ChIP-seq，能夠產(chǎn)生高分辨率的結(jié)果（Skene等，2015）。

該方法包括在室溫下用含1％甲醛的細(xì)胞中染色質(zhì)結(jié)合的DNA交聯(lián)10分鐘。洗滌細(xì)胞并重懸于裂解緩沖液中。在MNase消化后，通過短暫超聲處理使染色質(zhì)溶解，然后進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀。提取DNA，富集短片段，并用于制備測序文庫。

好處：

單基分辨率

缺點(diǎn)：

超聲處理可能引入序列偏差?（Teytelman et al。，2009）

無論持續(xù)時間如何，都能捕獲蛋白質(zhì)-DNA相互作用?（Zentner等，2015）

5.ORGANIC

從親和純化的天然分離的染色質(zhì)占據(jù)基因組的區(qū)域

有機(jī)物是一種溫和的方案，可避免交聯(lián)和超聲處理?（Kasinathan等，2014）。該方法是MNase-Seq和天然ChIP的組合，其提供復(fù)雜真核基因組中染色質(zhì)占據(jù)區(qū)域的精確圖譜。

好處：

避免超聲偏差?（Teytelman et al。，2009）

避免交聯(lián)偽影?（Zentner等，2014）

缺點(diǎn)：

蛋白質(zhì)的溶解性可能很差?（Zentner et al。，2014）

MNase序列偏倚?（Kensche等，2016）

細(xì)胞核隔離可能會引入偽影

其他實(shí)驗室沒有復(fù)制

6.CATCH-IT

共享附件標(biāo)簽以捕獲組蛋白并識別營業(yè)額

、CATCH-IT是一種測量全基因組核小體轉(zhuǎn)換動力學(xué)的直接方法?（Deal et al。，2010）。在該方法中，用甲硫氨酸替代物疊氮高丙氨酸（Aha）簡單處理細(xì)胞，其將生物素與含有新?lián)饺氲慕M蛋白的核小體偶聯(lián)。標(biāo)記的染色質(zhì)用鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行親和純化，嚴(yán)格洗滌以除去非組蛋白，并使用平鋪微陣列進(jìn)行分析。

好處：

可以確定整個基因組中核小體轉(zhuǎn)換的差異

缺點(diǎn)：

潛在的人工制品

7.ChIP-Seq/HT-ChIP/ChIP-exo/Mint-ChIP

染色質(zhì)免疫沉淀測序/高通量ChIP /核酸外切酶修剪ChIP /多重ChIP

ChIP-Seq是一種成熟的方法來繪制特定的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)?（Solomon等，1988）。它產(chǎn)生了大量的衍生物，如AHT-ChIP-Seq?（Aldridge等，2013），BisChIP-Seq?（Statham等，2012），CAST-ChIP（Schauer等，2013）。，芯片BMS?（Li等人。，2011），芯片BS-SEQ?（Brinkman等人，2012），ChIPmentation?（的Schmidl等人，2015）?，刪除片?（Rotem公司等人，2015）?，薄荷-ChIP?（van Galen等，2016），PAT_ChIP?（Fanelli等，2011），reChIP-seq?（Truax等，2012），scChIP-seq（Rotem等，2015）和X-ChIP?（Skene等，2014）。順序ChIP-seq（reChIP）也可以顯示染色質(zhì)上不同蛋白質(zhì)的關(guān)聯(lián)?（Elsasser等，2015）。在該方法中，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物在體內(nèi)交聯(lián)。接下來，將樣品片段化并用外切核酸酶處理以修剪未結(jié)合的寡核苷酸。蛋白質(zhì)特異性抗體用于免疫沉淀DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。提取，純化和測序DNA，得到蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的高分辨率序列。

好處：

蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的堿基對分辨率

可以繪制特定的調(diào)節(jié)因子或蛋白質(zhì)

外切核酸酶的使用消除了未結(jié)合DNA的污染?（Zentner等，2012）

缺點(diǎn)：

非特異性抗體可稀釋感興趣的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物庫

目標(biāo)蛋白必須是已知的并且能夠產(chǎn)生抗體

8.HITS-FLIP

采用熒光配體相互作用分析的高通量測序

HiTS-FLIP是一種在前所未有的深度測量定量蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合親和力的技術(shù)。在該方法中，內(nèi)置于高通量測序儀中的光學(xué)器件用于可視化蛋白質(zhì)與流動細(xì)胞中測序的DNA的體外結(jié)合?（Nutiu等人，2011）。

通過合成對具有錨定的單鏈DNA的微流體流動細(xì)胞進(jìn)行測序。剝離第二鏈DNA并使用Klenow聚合酶和未修飾的dNTP重建以形成雙鏈DNA簇。以不同濃度引入熒光標(biāo)記的結(jié)合蛋白，并對結(jié)合進(jìn)行成像。

好處：

量化和全面

缺點(diǎn)：

需要專門的硬件

尚未被科學(xué)界廣泛采用

9.Chem-seq

識別被小化學(xué)分子束縛的位點(diǎn)

Chem-seq可用于檢測小分子配體（如治療藥物）與基因組相關(guān)蛋白的結(jié)合。該信息可以提供關(guān)于小分子藥物對細(xì)胞功能的擾動的重要見解?（Anders等，2014）。

Chem-seq方法使用2種方法。在活細(xì)胞中，添加生物素化的藥物以允許藥物 – 靶標(biāo)結(jié)合。將復(fù)合物與甲醛交聯(lián)，將細(xì)胞裂解并超聲處理，并將復(fù)合物捕獲在鏈霉抗生物素蛋白珠上。將富集的DNA片段純化并測序。對于體外分析，將生物素化的藥物加入細(xì)胞提取物中，并按照體內(nèi)方法進(jìn)行剩余的步驟。

好處：

可應(yīng)用于生命，人體細(xì)胞

缺點(diǎn)：

創(chuàng)建生物素衍生物可能會改變藥物活性

10.FAIRE-seq/Sono-Seq

甲醛輔助分離調(diào)節(jié)元件/交聯(lián)染色質(zhì)的超聲處理

FAIRE-seq?（Giresi等，2009）?（Hogan等，2006）?和Sono-Seq?（Auerbach等，2009）?基于DNA和核小體或序列特異性DNA結(jié)合蛋白之間交聯(lián)效率的差異。。在該方法中，使用甲醛在體內(nèi)簡單地交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后將樣品裂解并超聲處理。苯酚/氯仿提取后，純化水相中的DNA并測序。測序提供了未被組蛋白占據(jù)的DNA區(qū)域的信息。

好處：

簡單且高度可重復(fù)的協(xié)議

不需要抗體

不需要酶，如DNase或MNase，避免酶處理所需的優(yōu)化和額外步驟

不需要單細(xì)胞懸液或核分離，因此很容易適用于組織樣本?（Simon et al。，2012）

缺點(diǎn)：

無法識別與DNA結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白

DNase-Seq可能更好地鑒定高表達(dá)基因的核小體缺失啟動子?（Song et al。，2011）

ATAC-SEQ

轉(zhuǎn)座酶 – 可及的染色質(zhì)測序/ ATAC-seq的測定針對血細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化

ATAC-Seq使用Tn5轉(zhuǎn)座體檢測基因組的無核小體區(qū)域?（Buenrostro等，2013）。該方法是常用的，并且優(yōu)化的方案可用于組織，例如血液（Fast-ATAC）?（Corces等人，2016），神經(jīng)元?（Milani等人，2016），生物樣本標(biāo)本?（Scharer等人，2016）。）和單細(xì)胞（scATAC-seq?（Buenrostro等，2015）和單細(xì)胞ATAC-seq?（Cusanovich等，2015））。

在該方法中，將gDNA與Tn5轉(zhuǎn)座體一起溫育，其在開放的染色質(zhì)區(qū)域中將其片段化并同時添加銜接子。純化區(qū)域的深度測序提供了基因組中無核小體區(qū)域的堿基對分辨率。

好處：

兩步方案，無適配子連接步驟，凝膠純化或交聯(lián)反轉(zhuǎn)

與FAIRE-Seq相比，信噪比高

缺點(diǎn)：

在機(jī)械樣品處理過程中，結(jié)合的染色質(zhì)區(qū)域可能會打開并被轉(zhuǎn)座組標(biāo)記

只有一半的分子含有PCR擴(kuò)增所需方向的銜接子

適配子位點(diǎn)之間的距離可能不是PCR擴(kuò)增的最佳選擇?（Sos et al。，2016）

12.CHIA-PET

配對末端標(biāo)簽測序的染色質(zhì)相互作用分析

ChIA-PET具有免疫沉淀步驟以繪制長程DNA相互作用，類似于Hi-C?（Li等人，2010）?（Fullwood等人，2009）。在該方法中，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物被交聯(lián)和片段化。特異性抗體用于免疫沉淀目的蛋白質(zhì)。將具有獨(dú)特條形碼的兩組接頭以分開的等分試樣連接到DNA片段的末端，然后基于接近度自連接。沉淀DNA等分試樣，用限制酶消化，并測序。深度測序提供了連接片段的堿基對分辨率。Hi-C和ChIA-PET目前在人類基因組中提供最佳的分辨率平衡和合理的覆蓋率，以繪制遠(yuǎn)距離相互作用（Dekker等，2013）。

Tang等人（Tang等人，2015）發(fā)表了一種改進(jìn)的方案，稱為高級或長讀取ChIA-PET?。該方法用2個半接頭和單個生物素化的接頭連接取代2個單獨(dú)的連接反應(yīng)。接下來，將去交聯(lián)的純化的DNA片段化，并使用Tn5轉(zhuǎn)座酶在一個步驟中連接銜接子。最后，對DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序?（Sati et al。，2016）

好處：

適用于全球檢測大量長程和短程染色質(zhì)相互作用?（Sajan等，2012）

研究特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物的相互作用

公共ChIA-PET數(shù)據(jù)集可通過ENCODE項目獲得?（Consortium等，2011）

去除傳統(tǒng)ChIP分析過程中產(chǎn)生的背景

免疫沉淀步驟降低了數(shù)據(jù)復(fù)雜性

缺點(diǎn)：

需要大量原料，通常至少1億個細(xì)胞?（Mumbach等，2016）

非特異性抗體可以降低不需要的蛋白質(zhì)復(fù)合物并污染池

連接子可以自我連接，產(chǎn)生關(guān)于真正DNA相互作用的模糊性

靈敏度有限;?可以檢測到少至10％的相互作用

13.3-C

染色質(zhì)構(gòu)象捕獲測序

3C-Seq?（Duan等人，2012），Capture-C和Hi-C?（Lieberman-Aiden等人，2009）?包括用于分析染色質(zhì)相互作用的一系列方法。Capture-C使用磁珠將生物素化片段的額外下拉添加到3C方法中?？梢允褂肅apture-C方法（NG Capture-C）的新改進(jìn)?（Davies等，2016）。Hi-C方法將3C-Seq擴(kuò)展到全基因組染色質(zhì)接觸圖，并且它也已應(yīng)用于原位染色質(zhì)相互作用的研究（Sati等，2016）?（Rao等，2014）。

在該方法中，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物與甲醛交聯(lián)。將樣品片段化，并用限制酶提取，連接和消化DNA。對得到的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。深度測序提供了連接片段的堿基對分辨率。

好處：

允許檢測遠(yuǎn)距離DNA相互作用

高通量方法

缺點(diǎn)：

檢測可能是由隨機(jī)染色體碰撞引起的

不到1％的DNA片段實(shí)際上產(chǎn)生了連接產(chǎn)物?（Bourgo等，2016）

由于多個步驟，該方法需要大量的起始材料

14.4C-seq

圓形染色質(zhì)構(gòu)象捕獲

4C?（Zhao等人，2006），（Simonis等人，2006），也稱為4C-seq，是類似于3C的方法，有時稱為圓形3C。它允許無偏見地檢測與特定感興趣區(qū)域相互作用的所有基因組區(qū)域（Sajan等，2012）。在該方法中，使用甲醛交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。將樣品破碎，連接并消化DNA。得到的DNA片段自我環(huán)化，然后進(jìn)行反向PCR和測序。深度測序提供了連接片段的堿基對分辨率。

好處：

評估各個基因組位點(diǎn)的DNA接觸譜的優(yōu)選策略

高度可重復(fù)的數(shù)據(jù)

缺點(diǎn)：

將錯過感興趣區(qū)域的本地交互（<50 kb）

大圓圈不能有效放大

15.5C

染色質(zhì)構(gòu)象捕獲碳復(fù)制

5C?（Dostie等人，2007）?允許同時確定多個序列之間的相互作用，并且是3C的高通量版本?（Sajan等人，2012）。在該方法中，使用甲醛交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。將樣品片段化并連接DNA并用限制酶消化。使用連接介導(dǎo)的PCR擴(kuò)增得到的DNA片段并測序。深度測序提供了連接片段的堿基對分辨率。

好處：

與4C不同，5C為許多對站點(diǎn)提供了交互頻率矩陣?（de Wit et al。，2012）

可用于重建較大基因組區(qū)域的（平均）3D構(gòu)象

缺點(diǎn)：

需要監(jiān)管站點(diǎn)的先驗信息?（Sati et al。，2016）

檢測可能不一定意味著由隨機(jī)染色體碰撞引起的相互作用

無法擴(kuò)展到需要大量引物的全基因組研究

16.PB_seq

蛋白質(zhì)/ DNA結(jié)合后跟隨高通量測序

PB_seq是一種DNA結(jié)合分析，可以在沒有染色質(zhì)的情況下在全基因組范圍內(nèi)表征DNA蛋白結(jié)合能量景觀?（Guertin等，2012）。它屬于通常通過指數(shù)富集（SELEX）系統(tǒng)進(jìn)化配體的方法家族?（Ozer等，2014）。對基因組DNA進(jìn)行超聲處理，大小選擇和純化。在與DNA結(jié)合蛋白雜交后，分離，提取蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA并制備用于測序。

好處：

確定與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)無關(guān)的結(jié)合效率

缺點(diǎn)：

尚未被科學(xué)界廣泛采用

17.Pu-seq

聚合酶使用測序

Pu-seq提供直接的復(fù)制起源位置和效率數(shù)據(jù)，以及復(fù)制時間的間接估計?（Daigaku等，2015）。

含有雙鏈核糖核苷酸的DNA的堿處理導(dǎo)致磷酸骨架對核糖的裂解3’，產(chǎn)生5’羥基末端。如果變性DNA用作隨機(jī)六聚體引物延伸的模板，則5ê至3ê合成導(dǎo)致鄰近初始核糖的齊平末端。通過從單鏈DNA產(chǎn)生文庫并在每個末端放置不同的索引引物，可以將測序讀數(shù)定位到單個鏈，以確定具有單堿基準(zhǔn)確度的原始核糖核苷酸位置。

好處：

單基準(zhǔn)確度

缺點(diǎn)：

僅適用于酵母

18.SELEX or SELEX-seq / HT-SELEX

通過指數(shù)富集的指數(shù)富集/高通量配體系統(tǒng)演化的配體的系統(tǒng)演化

自1990年3個獨(dú)立小組描述第一次SELEX實(shí)驗時?（Ellington等，1990）?（Tuerk等，1990）（Sullenger等，1990），該方法適用于廣泛的范圍技術(shù)?（Chen et al。，2016）?（Takahashi et al。，2016）。為NGS開發(fā)了一種高度多路復(fù)用的并行HT-SELEX方法?（Jolma等，2010）。SELEX-seq的變體?（Slattery等，2011）?使用Nextera銜接子序列進(jìn)行有效的文庫制備?（Zhang等，2016）。

在該方法中，蛋白質(zhì)表達(dá)為與pD40htSELEX表達(dá)載體中與高斯熒光素酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合肽（SBP）的融合體。每個DNA配體含有14bp隨機(jī)區(qū)域（14N）和5bp條形碼，其唯一地識別單個SELEX樣品。部分嵌套的引物用于連續(xù)的SELEX輪次。將含有所有可能的14bp序列的雙鏈DNA混合物與固定在96孔板的孔中的DNA結(jié)合蛋白一起溫育，導(dǎo)致DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合。洗滌和洗脫后，通過PCR擴(kuò)增得到的更具特異性序列的群體并測序?（Caroli等，2016）

好處：

高通量和高效率

軟件管道可用?（Hoinka等，2016）（Caroli等，2016）

缺點(diǎn)：

可能包含序列偏差

19.HITS-FLIP

采用熒光配體相互作用分析的高通量測序

好處：

量化和全面

缺點(diǎn)：

需要專門的硬件

尚未被科學(xué)界廣泛采用