近年二代基因測序（next-generation sequencing，NGS）技術快速發(fā)展，其應用已進展至臨床檢測，如遺傳疾病、實體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類白細胞抗原分析及非侵襲性產(chǎn)前篩查等。中華醫(yī)學會病理學分會和中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專委會前期組織病理、臨床、生物信息等專家進行了充分討論，擬在 NGS 的操作流程、數(shù)據(jù)處理、結果解讀等方面作規(guī)范和建議，以規(guī)范 NGS 在分子病理領域的應用。

llumina 公司讓基因成為人們生活中更為重要的角色。基因組學的重要性和價值將得以挖掘，勢必會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟價值。

如果您曾經(jīng)使用過 23andMe，Ancestry 或者任何其他基因測定服務，那么很有可能你的基因已經(jīng)被價值 250 億美元的生物儀器設備測定過了。作為美國 DNA 測序領域的領頭羊，Illumina 通過銷售它的基因測定硬件及試劑給全世界的醫(yī)療開發(fā)人員，目前已經(jīng)超過了所有的競爭對手。

臨床分子病理實驗室 NGS 樣（formalin-fixedparaffin-embedded，F(xiàn)FPE）、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊、石蠟包埋標本和血漿 / 血液標本等。本共識特色是基于病理評估的組織樣本（FFPE、新鮮）的規(guī)范。測序分析范圍基于目前臨床需求，本共識著重在于目標區(qū)域測序（panel）分析的實踐。隨著技術的更新和應用的成熟，本共識將持續(xù)更新以滿足臨床需求。

一、實驗室總體要求

1. NGS 檢測人員的資質要求：NGS 檢測技術人員應具備臨床病理學、分子生物學的相關專業(yè)大專以上學歷，并經(jīng)過 NGS 技術的理論與技能培訓合格。數(shù)據(jù)分析人員應具有臨床醫(yī)學或分子生物學或遺傳學知識背景并經(jīng)生物信息學培訓。最終報告應由中級或碩士以上具有病理學背景、經(jīng)培訓合格的本單位執(zhí)業(yè)醫(yī)師或者授權簽字人 (醫(yī)學博士學位或高級職稱) 審核。

2. NGS 檢測實驗室的區(qū)域設置要求：原則上 NGS 實驗室應當有以下分區(qū)：樣本前處理區(qū)、試劑儲存和準備區(qū)、樣本制備區(qū)、文庫制備區(qū)、雜交捕獲區(qū) / 多重 PCR 區(qū)域（第一擴增區(qū)）、文庫擴增區(qū)（第二擴增區(qū)）、文庫檢測與質控區(qū)、測序區(qū)、數(shù)據(jù)存貯區(qū)。各工作區(qū)空氣及人員流向需要嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》。分區(qū)可根據(jù)實際情況合并，但是在前處理和建庫時，血液樣本應與組織樣本分開。

3. NGS 檢測試劑及項目要求：試劑和測序平臺均應選擇中國食品藥品監(jiān)督管理總局 (CFDA) 認可產(chǎn)品。涉及到實驗室自配試劑，應該有嚴格的試劑制備標準操作規(guī)程（SOP），需經(jīng)過臨床實驗室自建項目 (LDT) 驗證合格才可使用。每個 NGS 檢測項目在驗證時需要根據(jù)建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類型包括，單堿基突變 single nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷貝數(shù)變異 Copynumber variations（CNVs）、染色體結構變異，structuralvariation（SVs）以及不同的樣本類型（如 FFPE 組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定 panel 的準確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數(shù)進行 LDT 驗證。應該有經(jīng)過標準品測試的在不同的 mutant allele frequencies（MAF）下，不同測序深度的靈敏度及特異性數(shù)據(jù)，確定不同樣本的可信的測序深度。經(jīng)驗證后，SOP 發(fā)生的任何改動，包括試劑、儀器、基因項目等都需要重新做驗證。驗證實驗結果簽名留底備案。

4. NGS 檢測實驗室的質量管理要求：NGS 檢測主要包括實驗操作和生物信息學分析兩部分。實驗操作部分包括樣本準備、文庫制備、編碼（barcoding）、目標區(qū)域富集、測序等；生物信息學分析部分包括定位（mapping）、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。上述流程均需要建立實驗室質量管理體系文件和 SOP 及機器運行和維護 SOP，具有嚴格的室內質控措施；定期參加室間質評以有及持續(xù)的質量保證和改進計劃。

二、NGS 分析樣本、基因 panel 和轉運要求

? NGS 分析樣本類型可采用 FFPE 樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊石蠟包埋標本和血漿 / 血液標本等。
? 對于腫瘤體細胞變異初次 NGS 檢測應首-選經(jīng)病理評估的組織樣本，在此數(shù)據(jù)基礎上的再次檢測可選取液體樣本動態(tài)監(jiān)測。
? NGS 檢測前需通過病理診斷明確其腫瘤的性質及含量，根據(jù)不同腫瘤類型選擇合適的基因 panel 測序。
? 不同疾病的基因 panel 列表，必須由臨床與檢測機構的專家共同決定，已達到不同實驗室之間的可比性和完善性。
? 未經(jīng)病理評估的基因檢測結果不可單獨用于分子病理臨床診斷目的。
? 樣本質量對檢測結果和分析至關重要，病理醫(yī)師需要對可評估的樣本進一步明確病理診斷，并評價標本有無出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理（例如含 HCl 脫鈣液處理），病變細胞（如腫瘤細胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標本中腫瘤細胞含量建議達到 20% 以上，低于此標準可富集后檢測。
? NGS 檢測實驗室應對不同類型的樣本有采集及處理 SOP 指導。對于不同的樣本（FFPE、體液、血液等）實驗室應有不同的樣本運送 SOP，物流環(huán)節(jié)（含冷鏈運輸）應有相關運送記錄，確保樣本運送安全、無污染、無降解。

三、NGS 檢測流程中的質量標準

1. 核酸提取及其質量分析：提取的核酸質量是 NGS 檢測成功的關鍵因素，在制備文庫前應采用多種方法對核酸質量評估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據(jù)不同的樣本類型制定相應的 SOP 用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對應明確接受和拒絕的標準。

2. 文庫制備及其質量分析：文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫，無論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應對檢測基因、區(qū)域或突變熱點進行描述，并建立實驗室檢測 SOP。建立好文庫后上機測序前需對文庫進行質量分析。每個檢測項目應設定其文庫質量的要求，明確接受或拒絕的標準。

3. NGS 測序儀上機分析及其質量分析：NGS 建庫主要有擴增法和捕獲法兩大策略，測序時根據(jù)檢測樣本量和質量要求確定適當?shù)男酒?，以保證測序質量和靶區(qū)覆蓋深度。錄入樣本編號、檢測內容、設定參數(shù)等信息，按儀器操作流程進行測序。

4. NGS 檢測中的樣本追蹤及對照設置：
（1）樣本追蹤：為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個 SNV 位點或其他標簽作為樣本身份標識（sample ID），在檢測前對每個樣本進行 SNV 位點信息的測定，在 NGS 檢測后對上述位點進行追蹤，證明沒有交叉污染。
（2）陽性對照：應用組合型質控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復雜性。實驗時同時檢測，以確保其檢出能力。
（3）陰性對照：用無核酸或明確無突變的樣本作為模板同時進行檢測，以確保檢測過程中沒有污染或非特異性。
（4）應對方案和替代方法：各個質量控制步驟中如出現(xiàn)異?；蚴?，實驗室應有應對措施或備選方案；對于測序結果質量差或有問題的區(qū)域應建立替代方法（如 Sanger 測序）。

四、生物信息分析

NGS 數(shù)據(jù)的生物信息分析可分為兩個主要步驟：一是對測序數(shù)據(jù)進行質控分析及過濾。二是對通過質控的序列進行變異位點鑒定分析并注釋。所用各種生物信息分析軟件，都要通過適量標準品測序數(shù)據(jù)進行驗證，證明所用軟件及參數(shù)可達到臨床報告的要求。

1. NGS 生物信息分析流程標準：
（1）質控分析：為保證分析結果的可靠性，需要對原始的測序數(shù)據(jù)進行質量控制與過濾。測序數(shù)據(jù)的質量控制主要包含 4 個方面：質量評估、去接頭序列、去低質量序列、去重復序列。
（2）序列比對（mapping）：將通過質控后每一條 read 與參考基因組進行比對，回貼到基因組上最佳位置。
（3）變異鑒定：對每個位點進行變異鑒定。在腫瘤 panel 測序中，主要檢測 SNV 和 Indel 兩種突變類型，參數(shù)調整后可分析 CNV。部分 panel 的設計還可以鑒定染色體易位。對于腫瘤 panel 基因測序數(shù)據(jù)，鑒定后的變異位點都需要進行該位點可視化查看和確認，如 The IntegrativeGenomics Viewer (IGV)。
（4）變異注釋：基于通用數(shù)據(jù)庫，對突變基因位點進行功能注釋，詳見下文。

2. NGS 生物信息分析流程質量管理：實驗室應建立生物信息學程序 /Pipeline 的書面質量管理 (QM) 計劃文件。必須包含每次運行時監(jiān)測和評估運行性能的指標和質控參數(shù)，以及定期（例如每月、每季度）監(jiān)測的指標和質控參數(shù)。指標和質控參數(shù)可包括但不限于標準品的突變類型及百分比。生物信息分析流程建立后，需要采用已知變異類型和變異頻率的標準品進行驗證，驗證其特異性和靈敏度是否達到實驗室要求。驗證結果簽名留底備案。
（1）NGS 數(shù)據(jù)存儲：實驗室需要在生物信息分析過程中對原始數(shù)據(jù)及最后的結果數(shù)據(jù)進行標準化存儲，并要保存相應的年限以備查。
（2）版本可追溯性：每份病例數(shù)據(jù)分析報告中，生物信息數(shù)據(jù)分析流程所涉及軟件、算法、參數(shù)及數(shù)據(jù)庫的版本必須可溯源。
（3）異常記錄。實驗室需要建立一個異常記錄文檔，用來記錄偏離 NGS 生物信息分析標準分析流程的檢測。

3. NGS 生物信息分析質量指標

4. NGS 數(shù)據(jù)存儲格式標準：為了規(guī)范和管理各類數(shù)據(jù)，各個實驗室需按照編號進行數(shù)據(jù)管理，所有數(shù)據(jù)按照國際標準格式進行存儲。必須建立本地變異數(shù)據(jù)庫（用于檢驗變異真實性）。

5. NGS 數(shù)據(jù)存儲傳輸及共享安全標準：實驗室需要制定規(guī)章制度以確認測序。數(shù)據(jù)在內部及外部存儲及傳輸過程中的安全性和機密性。正常人群的變異數(shù)據(jù)應該共享。

五、NGS 結果解釋及報告

1. NGS 臨床報告包含內容：基于高通量測序技術，臨床實驗室比較容易的獲取更高通量的臨床樣本檢測數(shù)據(jù)，不可避免會檢測到意義未知的變異位點，在實際工作中會有一定的不確定性。

2. 基因變異的命名：在描述所檢測出的基因變異時要遵循一定的原則和規(guī)范，推薦使用人類基因組變異協(xié)會命名指南。對于遺傳病相關基因變異命名，推薦美國醫(yī)學遺傳學學院

3. 臨床意義的解讀和批注：對于腫瘤體細胞突變，根據(jù)突變的類型和已有的報道及指南，基因變異提倡分級的處理方式

4. B 級：尚未進入診療指南，但已經(jīng)寫入該領域的專家共識的變異位點。注釋時要批注研究報道及專家共識的來源，明確其藥物及其臨床意義、正在開展的狀態(tài)等信息。
? ? C 級：FDA 或 CFDA 批準用于其他腫瘤可預測療效的基因變異，或者正在進行中的臨床試驗變異位點。注釋時要批注用于其他腫瘤的權威指南，研究文獻及臨床試驗正在開展的狀態(tài)等信息。
? ? D 級：處于學術爭議或臨床意義不明確的基因變異。同一實驗室應該有統(tǒng)一的政策用來應對檢測過程中出現(xiàn)的臨床意義不明變異情況。
對于以上幾種情況在報告的時候注意客觀平實地描述檢測的結果，在病理報告中不能出現(xiàn)建議使用何種治療手段或策略的語言。

5. 意義不明位點的處理：由于通量的增加和人種差異，臨床腫瘤樣本可能發(fā)現(xiàn)新的變異位點。實驗室必須制定相關政策方案用來應對檢測過程中出現(xiàn)的臨床意義不明變異情況。政策可以是一發(fā)現(xiàn)變異就報告，但附上說明和意義。也可以是不報道這些發(fā)現(xiàn)或只報道小部分變異結果。