REGENECYTE是一種源自人類臍帶血的異體造血干細胞療法，用于治療遺傳性、獲得性或由骨髓消融治療引起的造血系統(tǒng)疾病。臍帶血干細胞因其高度適應(yīng)性和安全性而備受關(guān)注，這些干細胞在嬰兒出生后安全采集，不會對母親或嬰兒造成傷害。REGENECYTE通過將這些干細胞移植到患者體內(nèi)，幫助其恢復(fù)造血和免疫功能，臨床試驗數(shù)據(jù)表明，76%的患者在42天內(nèi)白細胞數(shù)量恢復(fù)到健康水平，血小板和紅細胞數(shù)量也得到有效恢復(fù)。

然而，干細胞治療的廣泛應(yīng)用離不開高質(zhì)量的存儲和運輸解決方案。OriGen CryoStore 25 凍存袋憑借其卓越的性能和創(chuàng)新設(shè)計，為干細胞的長期保存和運輸提供了可靠支持，成為細胞治療領(lǐng)域的理想選擇。

CryoStore 25：為干細胞治療保駕護航

1. 高品質(zhì)材料與設(shè)計

Origen CryoStore 25 凍存袋采用堅固耐用的EVA材料，這種材料已被廣泛應(yīng)用于行業(yè)領(lǐng)先的CryoStore系列凍存袋中，以其卓越的耐用性和穩(wěn)定性著稱。CryoStore 25 凍存袋的密封接口和薄膜經(jīng)過嚴格測試，確保在低溫環(huán)境下的密封性和完整性，為干細胞提供最佳的保存條件。

2. 獨特的無針注射口

CryoStore 25 凍存袋配備“N”型管路，包含一個male luer接口、兩個female luers接口和一個無針注射口。這種無針設(shè)計不僅減少了針刺傷的風(fēng)險，還通過可擦拭的接口保持樣本的無菌性，即使在多次操作中也能維持樣本的完整性。

3. 靈活的包裝與定制

CryoStore 25 凍存袋提供多種包裝選擇，包括4袋/包和1袋/包，滿足不同實驗室和臨床需求。此外，Origen還提供定制化服務(wù)，可根據(jù)客戶的具體需求調(diào)整管路配置，確保產(chǎn)品與您的工作流程完美契合。

4. 符合國際標準

Origen CryoStore 25 凍存袋通過了CE認證、FDA 510(k)許可，并符合ISO 13485:2016和MDSAP認證，所有產(chǎn)品均按照GMP指南生產(chǎn)。這些嚴格的質(zhì)量標準確保了CryoStore 25 凍存袋在細胞治療領(lǐng)域的安全性和可靠性。

實驗前準備

1. 材料與試劑：新鮮小鼠脾臟、PBS緩沖液、無菌手術(shù)器械（剪刀、鑷子等）、細胞過濾器、CD4/CD8磁珠分選試劑（如需純化特定亞型），或陰選的方式去除B細胞、單核細胞、NK細胞的磁珠分選試劑，RPMI-1640培養(yǎng)基，人白介素2，胎牛血清，抗生素（如青霉素-鏈霉素）。
2. 設(shè)備：無菌操作臺、離心機、磁力分選架。

從小鼠脾臟獲取單細胞懸液

1. 小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡5分鐘，取出小鼠置于無菌操作臺上，左腹側(cè)朝上。
2. 在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口，撕開皮膚暴露腹壁，可見紅色長條狀脾臟。
3. 在脾臟下側(cè)提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪分離下面的結(jié)締組織，取出脾臟，剝?nèi)ブ車慕Y(jié)締組織，期間用含有2%FBS的PBS溶液保持脾臟濕潤。
4. 將脾臟放于70UM過濾網(wǎng)中，用注射器針芯輕輕研壓脾臟，用含2%FBS的PBS沖洗過濾網(wǎng)，獲細胞懸液。
5. 300G離心5分鐘，收集細胞沉淀，然后加入紅細胞裂解液裂解，將紅細胞充分裂解，收集白細胞。

從單細胞懸液中分離小鼠原代T細胞

1. 全T細胞分離：利用陰選的方式去除B細胞、單核細胞、NK細胞等，按照分選試劑盒的說明書進行。
2. 亞群分離（如需要CD4+或CD8+ T細胞）：
   • 使用CD4或CD8磁珠（如MACS磁珠）分選獲得特定T細胞亞群。
   • 將磁珠標記的細胞懸液置于磁性分選裝置中，分離出目標T細胞亞群。

培養(yǎng)與檢測

1. 將分離的T細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并加入抗生素與人白介素2。
2. 細胞密度一般控制在1-2×10^6 CELLS/ML，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染

企業(yè)介紹

02. 細胞培養(yǎng)與準備

03. 轉(zhuǎn)染操作

3.1 細胞準備

• 提前一天種板，準備貼壁細胞。
• 在96孔板中加入約2.5×10^4細胞，細胞過夜貼壁。
• 待細胞匯合度為70%-80%時，棄去培養(yǎng)基后，用Opti-MEM輕柔清洗細胞兩次，并加入20 μL Opti-MEM備用。

3.2 配置ProteanFect轉(zhuǎn)染體系

• 在40 μL Reagent A中加入0.5 μg EGFP mRNA，充分混勻。
• 往上述混合物中加入1.4 μL Reagent B混勻。

3.3 轉(zhuǎn)染

• 將上述ProteanFect轉(zhuǎn)染液加入細胞。
• 37℃培養(yǎng)箱孵育60分鐘。
• 棄轉(zhuǎn)染液（為避免細胞損失，無需完全棄盡）。
• 加入200 μL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24小時后檢測EGFP mRNA表達，48小時后檢測GFP pDNA表達。

04. 轉(zhuǎn)染檢測

實驗原理

• 利用帶正電的陽離子脂質(zhì)體與帶負電的DNA通過靜電作用力結(jié)合形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。
• 復(fù)合物被細胞膜表面吸附后通過內(nèi)吞作用進入細胞，在內(nèi)涵體內(nèi)釋放，可能通過膜融合或內(nèi)吞體破裂等方式將DNA釋放到細胞質(zhì)中。
• 最終DNA通過細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核，實現(xiàn)外源基因的表達。

• 核酸藥物與內(nèi)源蛋白自動組裝形成ProteanFect-核酸復(fù)合物。
• 細胞主動攝入ProteanFect-核酸復(fù)合物進入細胞，核酸分子釋放，內(nèi)源蛋白被內(nèi)在降解途徑降解。
• 外源基因表達。

操作步驟

1. 將核酸與Lipofection Reagent混合形成復(fù)合物。
2. 將復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)體系中進行轉(zhuǎn)染。
3. 經(jīng)過12-72小時后進行基因表達檢測。

1. 制備ProteanFect轉(zhuǎn)染體系。
2. 將ProteanFect轉(zhuǎn)染體系加入待轉(zhuǎn)染細胞。
3. 根據(jù)細胞類型孵育15-120分鐘，最快可在結(jié)束反應(yīng)1小時后觀察到目的基因的表達。

適用范圍

• 不適用于難轉(zhuǎn)細胞系和原代細胞，因為這些細胞可能對Lipo轉(zhuǎn)染產(chǎn)生較大毒性，轉(zhuǎn)染效率低，且對培養(yǎng)條件有特殊要求。

• 適用于多種細胞系，包括難轉(zhuǎn)細胞系和原代細胞，因為ProteanFect具有高轉(zhuǎn)染效率和低細胞毒性，且操作簡便。

企業(yè)介紹

原代T細胞的分離

原代T細胞的活化

培養(yǎng)與傳代

• 建議每2天對T細胞進行傳代，保持細胞密度在1×10^6/mL。
• 在T細胞激活后2-10天進行轉(zhuǎn)染，最佳轉(zhuǎn)染時間為激活后4-7天。

轉(zhuǎn)染操作

• 使用Opti-MEM培養(yǎng)基（或無血清RPMI 1640/無血清DMEM培養(yǎng)基）進行轉(zhuǎn)染。
• 推薦使用ProteanFect Max轉(zhuǎn)染試劑，它已被證明在人原代T細胞中實現(xiàn)高效和持久的基因表達。

實驗結(jié)果

2. CRISPR-Cas9系統(tǒng)簡介

3. ProteanFect CRISPR Cas9轉(zhuǎn)染機制

3.1 復(fù)合物形成

• Cas9 mRNA和sgRNA在細胞外與ProteanFect內(nèi)源蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

3.2 高效遞送

• 形成的復(fù)合物通過ProteanFect的高效遞送能力，穿透細胞膜，將Cas9 mRNA和sgRNA送入細胞。

3.3 快速釋放

• 一旦進入細胞，ProteanFect-核酸復(fù)合物迅速釋放Cas9 mRNA和sgRNA，準備進行基因編輯。

3.4 翻譯與復(fù)合物形成

• 釋放的Cas9 mRNA在細胞質(zhì)中被翻譯成Cas9蛋白，同時sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合，形成RNP（核蛋白）復(fù)合物。

3.5 基因組編輯

• RNP復(fù)合物進入細胞核，sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白到特定的基因位點，實現(xiàn)精確的DNA切割，啟動基因編輯過程。

4. ProteanFect CRISPR Cas9的優(yōu)勢

• 高轉(zhuǎn)染效率：在多種細胞系中實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。
• 低細胞毒性：減少對細胞的潛在傷害，提高實驗的安全性。
• 操作簡便：簡化了基因編輯流程，提高了實驗效率。

2. ProteanFect轉(zhuǎn)染機制

2.1 高效進入

2.2 快速釋放

2.3 高效表達

2.4 自組裝

2.5 天然降解

3. ProteanFect的優(yōu)勢

• 高轉(zhuǎn)染效率：在多種難轉(zhuǎn)染細胞系中表現(xiàn)出色。
• 低細胞毒性：減少了對細胞的潛在傷害。
• 操作簡便：簡化了轉(zhuǎn)染流程，提高了實驗效率。

4. 訂購信息

5. 企業(yè)介紹

1. 高效且可控的表達：mRNA能迅速翻譯為蛋白質(zhì)，表達短暫且可控，降低過度表達風(fēng)險。
2. 細胞友好：mRNA引入細胞內(nèi)不易造成損傷。
3. 安全性與低免疫原性：mRNA不整合入宿主基因組，降低基因突變風(fēng)險，降解產(chǎn)物為細胞自然成分。
4. 快速響應(yīng)與靈活性：mRNA快速合成能力使科學(xué)家能迅速調(diào)整實驗方案。

IVT的主要步驟

模板制備

• 以質(zhì)粒DNA為起點，通過瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒。
• 選擇超螺旋狀態(tài)最佳的菌株，進行線性化質(zhì)粒，選擇合適的限制性內(nèi)切酶（如BsaI）進行切割。

酶法加帽

• IVT后，使用牛痘病毒加帽酶和mRNA 2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶為mRNA加帽，增強穩(wěn)定性。

轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

• 準備線性化質(zhì)粒模板，加入轉(zhuǎn)錄緩沖液、NTPs和RNA聚合酶，在37°C孵育合成大量mRNA。

純化

• 采用柱純化、磁珠純化或酚/氯仿純化等方法，去除雜質(zhì)，提取純凈的mRNA。

定量與檢測

• 使用紫外吸收法、染料法或毛細管電泳法對mRNA進行定量和純度檢測。

共轉(zhuǎn)錄法加帽

• 為提高效率，可在IVT過程中直接加入帽子類似物，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄與加帽同步進行。

?IVT的主要試劑

轉(zhuǎn)染試劑選擇

ProteanFect

• 首款基于蛋白遞送的轉(zhuǎn)染試劑，非常適合mRNA轉(zhuǎn)染。
• 在多種難轉(zhuǎn)染細胞系中效率顯著優(yōu)于lipofectamine。

ProteanFect在難轉(zhuǎn)細胞中的應(yīng)用

• 在Jurkat T細胞中，ProteanFect展現(xiàn)出對多種類型核酸的高效遞送能力。

2. 材料與方法

2.1 CD34+造血干細胞的分選

使用動員人單采血或臍帶血，通過陽性選擇分選試劑盒分離CD34+細胞。推薦使用Lymphoprep（Stemcell, 07861）作為分離試劑，以及CD34 MicroBead Kit, human（Miltenyi Biotec, 130-046-702）進行細胞分選。

2.2 培養(yǎng)基的配制

• SFEM II培養(yǎng)基（Stemcell, 09655）和StemSpan CC100（Stemcell, 02690）以99:1比例混合。
• 若添加抗生素，需稀釋1000倍。
• 配制完成后，培養(yǎng)基應(yīng)放置于4°C冰箱儲存，并盡量在1個月內(nèi)使用完。

2.3 細胞培養(yǎng)與傳代

• 分選后的CD34+細胞以300g離心5分鐘，用1 mL完全培養(yǎng)基重懸后計數(shù)。
• 根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細胞重懸至105 cells/mL的密度，接種到T25培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板中。
• 3天后補液一次，若進行轉(zhuǎn)染實驗，需調(diào)整細胞密度至2×105 cells/mL，并隔天補液。

2.4 轉(zhuǎn)染操作

• 轉(zhuǎn)染核酸：mRNA。
• 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基：使用Opti-MEM培養(yǎng)基或無血清RPMI 1640/無血清DMEM培養(yǎng)基。
• 轉(zhuǎn)染體系：配置ProteanFect Max轉(zhuǎn)染體系，具體protocol需參考私戳獲取。
• 細胞準備：確保細胞活率超過90%，避免反復(fù)離心。
• 轉(zhuǎn)染過程：孵育時間建議15分鐘，適當(dāng)延長可提高轉(zhuǎn)染率，但可能影響細胞活力。
• 效率檢測：使用陽性對照mRNA，轉(zhuǎn)染后5-48小時內(nèi)觀察EGFP表達。細胞活率可通過鏡下觀察、臺盼藍、AO/PI染色或流式細胞術(shù)檢測。

3. 結(jié)果

華雅思創(chuàng)生物?專注于提供CGT、分子診斷和先進醫(yī)療的生物試劑和醫(yī)療耗材產(chǎn)品，我們的客戶遍及細胞治療、疫苗抗體、醫(yī)療診斷、腦科學(xué)、合成生物、長壽研究和醫(yī)美保健等領(lǐng)域。”買試劑，找華雅”，華雅思創(chuàng)生物?憑借深厚的技術(shù)實力和嚴格的質(zhì)量控制體系，已成為眾多科研機構(gòu)和生物制藥企業(yè)的首選供應(yīng)商。

• 高效轉(zhuǎn)染：能夠高效轉(zhuǎn)染 mRNA、siRNA、DNA 等多種核酸，適用于多種細胞類型。
• 低毒性：對細胞的損傷小，轉(zhuǎn)染后細胞狀態(tài)恢復(fù)快。
• 操作簡便：僅需 5-15 分鐘即可完成轉(zhuǎn)染，最快 1 小時內(nèi)觀察到 mRNA 表達。
• 適用廣泛：適用于原代細胞和難轉(zhuǎn)細胞系，如人原代 T 細胞、Jurkat T 細胞、HepG2 細胞等。
• 陽性對照：試劑盒包含編碼綠色熒光蛋白（EGFP）的 mRNA 和質(zhì)粒 DNA，驗證實驗操作及試劑效果。

• 基因表達研究：快速高效地將目標基因遞送至細胞內(nèi)，觀察基因表達效果。
• RNA干擾研究：通過 siRNA 轉(zhuǎn)染實現(xiàn)基因沉默，研究基因功能。
• 細胞功能研究：在原代細胞和細胞系中進行功能研究，如細胞增殖、凋亡、遷移等。

• 儲存條件：Reagent A 和 Reagent C 打開使用后保存于 2-8℃，Reagent B 保存于 -20℃，避免反復(fù)凍融。
• 運輸條件：干冰運輸，收到后應(yīng)存放于 -20℃，直至使用。

• 待轉(zhuǎn)染細胞：轉(zhuǎn)染前細胞必須處于良好的生長狀態(tài)，活率＞90%。對于原代細胞，建議在適當(dāng)活化后進行轉(zhuǎn)染。
• 推薦培養(yǎng)基：Opti-MEM 培養(yǎng)基（或無血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基/無血清 DMEM 培養(yǎng)基），提前預(yù)熱或恢復(fù)至室溫。
• 其他：完全培養(yǎng)基，無菌 EP 管、所需轉(zhuǎn)染的核酸樣品。

1. 配置 ProteanFect 轉(zhuǎn)染體系：
   • 在 40 μL Reagent A 中加入 0.5 μg mRNA，充分混勻。
   • 加入 1.4 μL Reagent B，輕柔充分混勻。
   • 對于原代細胞，加入 8 μL Reagent C 混勻。
2. 細胞處理：
   • 懸浮細胞：300 g 離心 5 分鐘，收集細胞沉淀，用 Opti-MEM 重懸并洗滌，調(diào)至 5×10? – 1×10? cells/mL 備用。
   • 貼壁細胞：轉(zhuǎn)染前匯合率應(yīng)保持在 50%-80%，用 Opti-MEM 輕柔清洗細胞兩次，加入 20 μL Opti-MEM 備用。
3. 細胞轉(zhuǎn)染：
   • 將配置好的 ProteanFect 轉(zhuǎn)染體系與 20 μL 細胞懸液或貼壁細胞混合均勻。
   • 37℃孵育 45-60 分鐘（細胞系）或 15-30 分鐘（原代細胞）。
   • 加入至少 200 μL 完全培養(yǎng)基，300 g 離心 5 分鐘，棄上清（為避免細胞損失，無需完全棄盡）；對于貼壁細胞，直接棄去混合液，補加培養(yǎng)基。
   • 加入適量完全培養(yǎng)基，進行細胞培養(yǎng)，后續(xù)可根據(jù)實驗?zāi)康倪M行基因表達檢測。

1. 如何提升轉(zhuǎn)染效率：
   • 延長轉(zhuǎn)染時間：根據(jù)細胞狀態(tài)適當(dāng)延長轉(zhuǎn)染時間。通常原代細胞不超過 1 小時，細胞系不超過 2 小時。
   • 提升 Reagent B 用量：適當(dāng)增加 Reagent B 的用量，以 96 孔板為例，原代細胞推薦為 0.7-1.4 μL，細胞系為 1-3 μL。
   • 提升 Reagent C 用量：對于細胞系轉(zhuǎn)染，可在體系中添加適當(dāng)?shù)?Reagent C，以 96 孔板為例，添加 8-13.5 μL，孵育 15 分鐘，最長不超過 45 分鐘；原代細胞則可將 Reagent C 體積增加至 13.5 μL，孵育時間同樣不超過 45 分鐘。
   • 提升 ProteanFect 轉(zhuǎn)染量：適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染體系至初始的 1.5-2.5 倍。
2. 質(zhì)粒 DNA 能否用于原代細胞轉(zhuǎn)染：
   • 雙鏈 DNA 轉(zhuǎn)染原代細胞可能引起一定的毒性，例如炎癥應(yīng)激，因此需根據(jù)實驗?zāi)康闹斏鬟x擇。以人或小鼠來源的原代 T 細胞為例，使用質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染可能導(dǎo)致顯著的細胞毒性，因此不適合此類細胞。而大多細胞系通常經(jīng)過多代培養(yǎng)，能更有效地應(yīng)對外源 DNA 帶來的壓力，對雙鏈 DNA 轉(zhuǎn)染的耐受性較高，因此可以使用質(zhì)粒 DNA 進行轉(zhuǎn)染。
3. 質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染要求：
   • 轉(zhuǎn)染效率受 DNA 質(zhì)量影響。建議使用無內(nèi)毒素試劑盒制備 DNA，并確保 OD 值在 1.7-1.9 之間；使用無核酸酶純水將 DNA 稀釋至 0.5-2 μg/μL 的濃度。
4. 細胞系轉(zhuǎn)染前處理：
   • 為獲得良好的轉(zhuǎn)染效率，建議使用活性超過 90%的細胞，可以通過臺盼藍染色測定細胞活性。
   • 不建議使用傳代次數(shù)超過 15 次的細胞進行實驗。
   • 新復(fù)蘇的細胞在轉(zhuǎn)染實驗前需傳代 2-3 次，待細胞恢復(fù)正常生長后使用。
5. 原代細胞轉(zhuǎn)染前預(yù)處理：
   • 對于原代細胞，充分活化有助于提高轉(zhuǎn)染效率，因此建議在適當(dāng)活化后進行轉(zhuǎn)染。例如，人原代 T 細胞可使用 CD3/CD28 磁珠或抗體進行激活，激活 2-10 天內(nèi)均可轉(zhuǎn)染，其中激活 4-6 天時轉(zhuǎn)染效率最高。
6. 關(guān)于試劑盒中陽性對照的使用建議：
   • 首次嘗試時，建議設(shè)置陽性對照組（EGFP mRNA 或 EGFP pDNA），以檢測實驗操作和試劑的有效性。使用 96 孔板的細胞量即可，節(jié)省細胞和試劑。
7. 轉(zhuǎn)染時的細胞數(shù)范圍：
   • 說明書中提供了最佳轉(zhuǎn)染條件下的細胞數(shù)量范圍，但在特殊情況下，即使細胞數(shù)量較少，也可以進行轉(zhuǎn)染。以 96 孔板為例，建議細胞數(shù)量不低于 4×103/孔，以確保后續(xù)檢測的可靠性。
8. 轉(zhuǎn)染后細胞狀態(tài)與活力：
   • 轉(zhuǎn)染后，細胞狀態(tài)可能與未處理組略有差異。但使用 ProteanFect 試劑進行轉(zhuǎn)染時，對細胞活力的損傷較小。通常在轉(zhuǎn)染后第二天，細胞狀態(tài)會基本恢復(fù)。
9. 轉(zhuǎn)染后細胞離心后看不到沉淀：
   • 對于小體積轉(zhuǎn)染體系（如 96 孔板），離心后細胞沉淀不明顯是正?，F(xiàn)象。細胞沉淀可能散落在離心管側(cè)壁，不影響后續(xù)結(jié)果。為減少細胞損失，離心后移液時應(yīng)避免槍頭緊貼底部。
10. 轉(zhuǎn)染體系擴大是否影響轉(zhuǎn)染效率：
    • 如轉(zhuǎn)染細胞量較大，推薦使用離心管進行孵育，轉(zhuǎn)染體系參照表 4，不會影響轉(zhuǎn)染效率。
11. 貼壁細胞如何轉(zhuǎn)染：
    • 對于貼壁細胞，可提前一天種板后進行轉(zhuǎn)染，也可消化成細胞懸液進行